NY_T 2810-2015 橡胶树褐根病菌鉴定方法
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ID： |
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文件大小(MB)： |
0.74 |
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9 |
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日期： |
2024-8-14 |
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ICS 65.020,B 16 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 2810—2015,橡胶树褐根病菌鉴定方法,Methods for identification of Phellinus noxius (Corner) G.H.Cunn of rubber tree,2015-10-09 发布2015-12-01 实施,中华人民共和国农业部发布,NY/T 2810—2015,刖 s,本标准按照GB/T 1. 1-2009给出的规则起草,本标准由农业部农垦局提出,本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会归口,本标准起草单位:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所、厦门出入境检验检疫局〇,本标准主要起草人:贺春萍、梁艳琼、林石明、李锐、吴伟怀、郑肖兰、郑金龙,I,NY/T 2810—2015,橡胶树褐根病菌鉴定方法,1范围,本标准规定了橡胶树褐根病菌(P/ie〃加〃sれ。加〃5)的术语和定义、鉴定依据、试剂及配制方法、采,样、症状鉴定、培养鉴定、PCR鉴定、结果判定、标本和样品保存等技术要求,本标准适用于橡胶树褐根病菌(P號”也5)的鉴定,2规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文,件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件,GB/T 28095木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法,3术语和定义,下列术语和定义适用于本文件,3. 1,橡胶树褐根病 brown root disease of rubber tree,由有害层孔菌［Pんe〃加〃s noxiws(Corner)G. H. Cunn］引起的ー种为害橡胶树根部的真菌病害。该,病害病原菌的危害症状和培养性状见附录A,4鉴定依据,依据褐根病菌在橡胶树上的为害症状、形态特征、室内病原菌培养性状以及PCR特异性反应进行,鉴定。根据褐根病菌核糖体基因内转录间隔区(rDNA- ITS)特有碱基序列设计特异性引物进行PCR,扩增。依据是否扩增获得预期653 bp的特异DNA片段,判断样品中是否携带橡胶树褐根病病菌,5试剂及配制方法,5. !马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),称取200 g洗净去皮的马铃薯,切碎,加一级超纯水900 mL煮沸30 min,纱布过滤,再加20 g葡萄,糖(化学纯)充分溶解后,用ー级超纯水定容至1 〇〇〇 mL,分装后,每100 mし培养基中加入2. 2 g琼脂粉,(高纯度)，121℃高温灭菌20min,4℃或室温保存备用。马铃薯葡萄糖液体培养基不加琼脂粉,5.2 试剂,琼脂粉、葡萄糖、无菌水、75%酒精、氯化钠、〇. 1%升汞、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na?)、氢氧化,钠(NaOH)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、冰乙酸、四环素、链霉素、异丙醇、无水乙醇、真菌DNA提取试剂,盒、琼脂糖、液氮、蒸储水、Tag DNA聚合酶、引物、DNA纯化试剂盒、PCR产物回收试剂盒、pMD18 - T,Vector、感受态细胞、Golden view核酸染料、DL 2000 Marker^TAE电泳缓冲液等,5.3 试剂配制,5. 3. 1 四环素(Tetracycline),称取0. 1 g四环素溶解于无水乙醇,定容至10 mL。以50 *g/mL终浓度添加于生长培养基,5. 3. 2 链霉素(Streptomycin),称取0.5 g链霉素硫酸盐溶解于足量的无水乙醇中,最后定容至10 mL。以lOO^g/mL的终浓度,NY/T 2810—2015,添加于生长培养基,5. 3. 3 1 moI/L Tris - HCI(pH 8. 0),称取!21. 1 g三羟甲基氨基甲烷(Tris,优级纯)溶解于800 mL ー级超纯水中,用盐酸(HC1,分析,纯)调pH至8. 0,加超纯水定容至1 〇〇〇 mL。分装后高温灭菌(121℃)2。min,4℃或室温保存备用,5. 3. 4 Wmol/LNaOH,称取80. 0 g氢氧化钠(NaOH,分析纯)溶解于160 mL ー级超纯水中,溶解后再加一级超纯水定容,到 200 mL?,5. 3. 5 1 mol/L EDTA-Na2(pH 8. 0),称取372. 2 g乙二镀四乙酸二钠(EDTA- Na2,优级纯),溶解于70 mL ー级超纯水中,再加入适量,NaOH溶液(5. 3. 4),加热至完全溶解后,冷却至室温,再用NaOH溶液(5. 3. 4)调pH至8. 0,加超纯水,定容至100 mL。分装后高温灭菌(121℃)20 min,4℃或室温保存备用,5. 3. 6 TE 缓冲液(pH 8.0),分别量取 1。mL Tris-HCl(5. 3. 4)和 1 mL EDTA-Na2(5. 3. 5),加一级超纯水定容至 1 000 mL,分装后高温灭菌(121℃)2O min,4℃或室温保存备用,5. 3. 7 50XTAE 电泳缓冲液(pH 8. 0),称取242.2 g三羟甲基氨基甲烷(Tris,优质纯),先用500 mL ー级超纯水加热搅拌溶解后,加入,100 mL EDTA-Na2(5. 3. 5),用冰乙酸(分析纯)调pH至8. 0,然后加一级超纯水定容到1 〇〇〇 mL。室,温保存备用,使用时用ー级超纯水稀释成IXTAE,5.3.8 PCR反应试剂,10>
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